随着人们对自由基生命研究的面法不断关注，氧化应激损伤和抗氧化保护作用的优化艺研究成为热点。因人体中抗氧化的绿豆物质有限当氧化剂与人体内抗氧化剂失去平衡时，人体会处于氧化应激状态。抗氧当体内的化肽氧化剂浓度超过细胞防御能力时，氧化损伤可引起如癌症，备工多发性硬化症和心血管疾病等疾病。面法目前最常见的优化艺是化学抗氧化剂，但因其有一定的绿豆毒副作用所以使用受到限制。近年来研究发现，抗氧由蛋白酶水解制得的化肽生物活性肽具有一定的抗氧化能力，水解出的备工抗氧化肽与大分子蛋白质相比，显具有更高的面法生物活性，抗氧化肽在体内积累具有清除自由基和抑制脂质过氧化的优化艺功能，能够维持机体内自由基的绿豆平衡，从而提高机体抗衰老和抗疾病的能力。抗氧化肽因其具有安全、高效、易吸收等特点，在保健、医疗等领域受到了管饭的重视。

绿豆又名青小豆，属于医食两用作物，是我国主要的粮食作物之一，在全国多地区种植，年均产量在6l万吨且富含高质量的植物蛋白，是优质的食品加工原料。食用绿豆益处繁多，如可以降低血脂、提高机体免疫力、预防衰老以及具有抗氧化等作用。绿豆多肽中的抗氧化活性肽相对分子质量小，具有良好的水溶性、低黏度、稳定性强，是天然的抗氧化剂，能够起到清除体内自由基、抑制生物大分子物质过氧化的作用，具有延缓衰老、预防疾病等优点，有很高的利用价值。但就目前而言，绿豆抗氧化多肽的制备工艺研究较少，不能满足现阶段的需求，生产成本较高，制备工艺不太成熟，对于绿豆多肽提取的研究有着重要意义。

一、材料与方法

1、材料及试剂

绿豆蛋白：实验室自制；盐酸：中国医药上海化学试剂公司；碱性蛋白酶(6000U/g)：Sigma试剂公司；氢氧化钠、DPPH、无水乙醇：以上均为分析纯，均购自天津市科密欧试剂有限公司。

2、主要仪器设备

紫外可见分光光度仪：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；精密pH计：梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；恒温干燥箱：湘仪离心机仪器有限公司；电子天平(RSJ200—4)：湘仪离心机仪器有限公司；离心机(TDZ5一WS)：湘仪离心机仪器有限公司。

3、实验方法

（1）绿豆抗氧化肽的制备

将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。

（2）DPPH自由基清除能力的测定

参照于慧等人的方法进行DPPH自由基清除率的测定。将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为A_i；将上述过程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，此条件下测定吸光值记录为A_j，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。
DPPH清除率计算公式如下：

A_i：样品组吸光度值；

A_j：对照组吸光度值；

A₀：空白组吸光度值。

（3）单因素实验

本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。

①酶解温度对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为9、酶解时间3h作为固定条件，测定当酶解温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五个条件下时的DPPH清除率。

②酶浓度对绿豆多肽抗氧化性的影响

将pH为9、酶解温度50℃、酶解时间3h作为固定条件，测定当酶浓度分别为2％、4％、6％、8％、10％五个条件下时的DPPH清除率。

③pH对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、酶解温度50℃、酶解时间3h作为固定条件，测定当pH分别为7、8、9、10、11五个条件下时的DPPH清除率。

④酶解时间对绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为9、酶解温度50℃作为固定条件，测定当酶解时间分别为0.5h、lh、2h、3h、4h五个条件下时的DPPH清除率。

（4）响应面优化设计

通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，进行回应面优化设计。因素和水平取值如表1所示。

二、结果与讨论

1、单因素实验结果

（1）绿豆多肽抗氧化性与酶解温度的关系

将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。结果如图1所示。

由图1可知，当酶解温度低于50℃，DPPH清除率与温度成正比，当温度超过50℃时，DPPH清除率开始下降。这是因为蛋白酶对稳定的要求较高，温度过低会影响酶解的反应速度，使酶解反应不彻底，从而影响抗氧化肽的抗氧化效果。而温度过高则会影响蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，无法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，从而使DPPH清除率降低。

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